Właściwości fizyczne białek

Biologia- nauka o życiu

Aminokwasy i białka

| Strona Główna | | Kontakt | Ekipa |

Właściwości fizyczne białek

Rozpuszczalność

Rozpuszczalność białek zależy o szeregu takich czynników jak: pH, rodzaj rozpuszczalnika, stężenie elektrolitu oraz typu jonów w środowisku. Ważną rolę odgrywa też charakter białka i jego cechy strukturalne. Dodatek słabo polarnych lub nie polarnych rozpuszczalników takich jak etanol lub aceton, do wodnego roztworu białka obniża względną przenikalność elektryczną układu. W efekcie obniża się rozpuszczalność i stopień hydratacji białek. Jeśli doda się odpowiednią ilość takiego rozpuszczalnika białko zaczyna się wytrącać. Bardzo ważne dla rozpuszczalności białek jest stężenie elektrolitu. Często konieczne jest utrzymanie odpowiedniego stężenia soli, aby w roztworze utrzymać białko o znacznej asymetrii w rozłożeniu ładunków. Jony soli gromadzą się na powierzchni białek i silnie podwyższają ich rozpuszczalność.

Efekt wytrącenia białka po dodaniu do roztworu soli związany jest z odwodnieniem cząsteczki białka, co jest konieczne do hydratacji dużego nadmiaru elektrolitu. Do wysalania stosuje się najczęściej siarczan VI amonu, ponieważ jest dobrze rozpuszczalny w wodzie, a jego jony są silniej hydratowane niż jony chlorku sodu. Ponieważ różne białka wytrącają się przy różnym stężeniu elektrolitów, metodę tą uważa się za bardzo ważną do wstępnego rozdzielenia mieszaniny białek w łagodnych warunkach.

Masa cząsteczkowa

Masa cząsteczkowa białek waha się od 105 do 106 u, w przypadku cząsteczek jednołańcuchowych, a od 5 * 104 do kilku milionów w przypadku większości białek. Do określenia masy cząsteczkowej i kształtu cząsteczek białkowych stosuje się wiele różnych metod fizyko-chemicznych, obejmujące pomiary lepkości, szybkości dyfuzji i sedymentacji w elektowirówce, określenie ruchliwości elektoferycznej i chromatograficznej oraz pomiary rozproszenia światła i ciśnienia osmotycznego.

Pomiary rozproszenia światła

Metoda związana z rozproszeniem światła opierają się na prostej zależności: wzrost wielkości cząsteczki powoduje wzrost efektu Tyndalla. Rozproszenie mierzy się porównując natężenie światła padającego i rozproszonego pod kątem prostym. W idealnych warunkach różnica pomiędzy rozproszeniem światła w czystym rozpuszczalniku i w roztworze białka jest wprost proporcjonalna do liczby i rozmiaru cząsteczek tego białka.

Ciśnienie osmotyczne

Ciśnienie osmotyczne można wyznaczyć osmometrem mierząc ciśnienie par (masa cząsteczki < 20 000 u) lub osmometrem membranowym (masa cząsteczki > 20 000 u).
W osmometrze membranowym ciśnienie osmotyczne określa się, mierząc różnice ciśnień hydrostatycznych w kapilarze wzorcowej i badanej. Czas potrzebny do osiągnięcia równowagi można skrócić przez zastosowanie osmometrii dynamicznej, w której mierzy się szybkość przepływu wody do lub z osmometru, przy różnych wartościach ciśnienia zewnętrznego. Szybkość ta może być automatycznie kompensowana. Metody osmometryczne obecnie są rzadko używane.

Ultrawirówka

W ultrawirówce masę cząsteczek białek można wyznaczyć na dwa sposoby. Metodą pomiaru szybkości sedymentacji oraz metodą równowagi sedymentacyjnej. W rotorze wirówki umieszcza się probówki z roztworem białka. W czasie wirowania w rotorze panuje bardzo niskie ciśnienie. Za pomocą specjalnego układu optycznego podczas wirowania można mierzyć stężenie białka w każdym punkcie wirówki.
W metodzie opartej na pomiarze szybkości sedymentacji konieczne jest wytworzenie takiego pola grawitacyjnego, które zapewniłoby całkowitą sedymentacje badanej substancji. Szybkość sedymentacji białka jest wprost proporcjonalna do jego masy cząsteczkowej. W celu wykonania pomiaru współczynnika sedymentacji i masy cząsteczkowej, roztwór białka umieszcza się w polu grawitacyjnym 500 000 razy silniejszym od przyciągania ziemskiego. Co można uzyskać w wirówce mającej 70 000 obrotów na minutę. Zmiany stężenia obserwuje się za pomocą specjalnego układu optycznego. Metodą tą można mierzyć gradient współczynnika refrakcji w każdym punkcie probówki. Metoda ta została opracowana przez Schlierena. Vbiałka można obliczyć, znając gęstość roztworu. Aby obliczyć masę cząsteczkową, należy też znać współczynnik dyfuzji. Dla cząsteczek globularnych można go obliczyć teoretycznie jednak w większości mamy do czynienia z białkiem nie globularnym współczynnik dyfuzji wyznacza się przez wirowanie z mniejszą prędkością i pomiar, spowodowanej dyfuzją, zmiany szerokości pliku sedymentacyjnego.
Aby masę cząsteczkową za pomocą metody równowagi sedymentacyjnej nie trzeba znać współczynnika dyfuzji. W porównaniu z metoda pomiaru szybkości sedymentacji, gdy roztwór białka jest wirowany w polu 500 000 g, pole grawitacyjne używane w tej metodzie wynosi tylko 10 000-15 000 g. W tych warunkach szybkość sedymentacji cząsteczki białka jest tego samego rzędu, co szybkość ich dyfuzji w rejonach o dużym stężeniu do rejonu o mniejszym stężeniu białka. W ciągu kilku godzin lub dni ustala się równowaga pomiędzy, w której wypadkowy przepływ cząsteczki staje się równy zeru. Masę cząsteczki wyznacza się za pomocą powstałego gradientu stężeń. Wadą tej metody jest długi czas wirowania potrzebny do ustalenia się równowagi.

Metoda filtracji żelowej

Elektroforeza na żelu poliakryloamidowym jest wariantem metody elektroforezy pasmowej. Monomer żelu rozpuszcza się w odpowiednim buforze, dodaje się bisakryloamid i polimeryzuje się w szklanych rurkach lub na płytkach. Żel powinien mieć grubość 7-10 cm. W wyniku elektroforezy uzyskuje się bardzo ostre rozdzielenie składników, co przypisuje się efektowi sił molekularnych. Kiedy proces elektroforezy prowadzi się w obecności siarczanu dodecylo-sodowego, białko oligomeryczne można rozdzielić na podjednostki i określić ich masy cząsteczkowe. Masę cząsteczkową wyznacza się przez porównanie ruchliwości elektroforetycznych substancji badanej i białka wzorcowego. Dokładność oznaczenia wynosi 5-10%. Zaletą tej metody jest szybkość (2-4 h) oraz czułość (zaledwie 10-50 ?m białka).Ten rodzaj elektroferazy można zmodyfikować przez umieszczenie przed żelem właściwym małej warstwy materiału polimerycznego, charakteryzującego się mniejszym stopniem u sieciowania, co zwiększa ostrość pasm. W metodzie elektroforezy słupkowej gdzie żel znajduje się w rurkach, białka rozdziela się przez poprzeczne pocięcie słupków żelu w krążki.

Wiele białek wykazuje tendencje do agregacji lub dysocjacji na podjednostki, dlatego tez dokładne zdefiniowanie ich masy cząsteczkowej nie jest łatwe. Często interpretacja wyników otrzymanych metodami fizyko-chemicznymi jest trudna. Normalną drogą postępowania jest sumowanie mas różnych frakcji i dzielenie ich przez liczbę cząsteczek w roztworze. Wyniki otrzymane metodą ultra wirowania są wartościami średnimi.

Białka hydrofilowe i hydrofobowe

Białka hydrofilowe mają duże powinowactwo do wody. Dipole wody skupiają się wokół powierzchni białka tworząc tzw. płaszcz wodny. Białka te są dobrze rozpuszczalne w rozpuszczalnikach polarnych przy różnych wartościach pH, a także w pI. Przykładem jest albumina osocza krwi lub białko jaja kurzego.

Białka hydrofobowe nie posiadają powinowactwa do rozpuszczalników polarnych ze względu, że ich powierzchnia jest utworzona jest z aminokwasów apolarnych. Białka te rozpuszczają się tylko jako kationy albo aniony, czyli są zdysocjowane i posiadają na swej powierzchni ładunki. Rozpuszczają się, więc w roztworach kwaśnych lub zasadowych w pH innym niż pI np. kazeina mleka.

| Do początku |

| Wstecz |